Atividade da Caspase-3 está presente em baixos níveis no espermatozóide humano ejaculado.
Weng S.L., Schuffner Alessandro, et al. Fertility and Sterility, 2001, 76 (3S); P-244: S193.
Objetivo
Homens com espermatozóides ejaculados tem mostrado diferentes níveis de fragmentação de DNA e translocação de fosfatidilserina (PS) na membrana, típico de marcadores de apoptose em células somáticas. O objetivo deste estudo foi determinar se caspases ativas estão presentes em espermatozóides e se o aparecimento de marcadores de apoptose típicos são caspase-dependente.
Design
Estudo prospectivo, experimentos controlados.
Materiais e métodos
Os espermatozóides de pacientes inférteis (n520) e doadores férteis (n511) foram examinados após separação em gradiente de Percoll das frações com alta motilidade (camada de 90%) e baixa (camada de 45%). Os leucócitos foram removidos por adsorção esferas paramagnéticas exibindo o anticorpo anti-CD45. Espermatozóides foram avaliados por parâmetros de movimento (CASA), morfologia (Morfologia estrita), marcadores de apoptose, incluindo a fragmentação do DNA (TUNEL), translocação de PS (anexina-V vinculante) e ativação da caspase por três métodos, incluindo Ensaio fluorometrico in-vitro para hidrolise de deve-afc, análise de immunoblot para caspase-3, e microscopia de imunofluorescência. As medições foram realizadas em condições basais, após incubação com os estimulantes de apoptose [H?O2, staurosporina (STS), ou ligante Fas], após a incubação com os inibidores da caspase (z-VAD-FMK e z-DZVDfmk), na dose e tempo-dependente.
Resultados
A microscopia de Imunofluorescência localizou a caspases ativas somente na região da peça intermediaria. A atividade da Caspase foi detectada em baixos níveis nos espermatozóides humano, cerca de 400-1000 vezes menos que os níveis equivalentes de neutrófilos estimulados com STS. Atividade de Capazes foi encontrada em maior numero nos pacientes do que nos doadores para ambas as camadas de gradiente (45 e 90%). Pro-caspase (30kDa) foram encontradas em ambas as frações. Caspase ativa (18kDa) foi identificada na maioria dos pacientes e dos doadores na camada de 45% mas na minoria dos espermas da camada de 90%. Fragmentação de DNA e translocação de PS foram maior na camada e 45% do que na de 90%, mais altas nos pacientes do que nos doadores. Uma correlação positive significante entre a detecção por imunofluorescencia da atividade da caspase e fragmentação de DNA foi observada na fração de 45% dos pacientes. STS e H2O2 produziram pequenos ou nenhum aumento da atividade da caspase. STS mas não H2O2 ou Fas aumentou significativamente a fragmentação de DNA. Pré-incubação com inibidores de caspase não tem efeito na fragmentação de DNA nem na translocação de PS.
Conclusões
Para o melhor de nosso conhecimento, este é a primeira inequívoca evidência para a presença activa da caspase-3 em espermatozóides humanos ejaculado. Frações de espermatozóides com níveis altos de caspases ativos foram correlacionados com translocação PS e fragmentação do DNA em pacientes inférteis e frações com baixa motilidade, sugerindo que a apoptose caspase-dependente. A detecção de imunofluorescência exclusiva da caspase-3 ativa na peça intermediaria sugere que o mecanismo de apoptose caspase-dependente pode originar-se na gota citoplasmática. No entanto, a baixa correlação entre a atividade da caspase e marcadores apoptóticos, e o aparecimento de marcadores de apoptose com Não STS-, H2O2, e Fas- estimulado ativação da caspase sugerem que mecanismos de caspase-independente podem estar associados com os espermatozóides humanos. Compreender tais mecanismos pode proporcionar os meios para manipular a apoptose para ganho terapêutico.